1．多管發(fā)酵法

初發(fā)酵實驗  發(fā)酵管內(nèi)裝有單倍或三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，并在內(nèi)倒置有小玻璃管。每個樣品用三個不同的水樣量接種,，同一接種水樣量要有五管，將水樣分別接種到裝有乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的發(fā)酵管中,，在37℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h。乳糖能起選擇作用,，因為很多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖,，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。培養(yǎng)液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑,，細(xì)菌產(chǎn)酸后,，培養(yǎng)液即由原來的紫色變成黃色。產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管表明試驗陽性,，如在倒管內(nèi)產(chǎn)氣不明顯，可輕拍發(fā)酵管,，有小氣泡升起為陽性,。

復(fù)發(fā)酵實驗  輕微振蕩初發(fā)酵試驗陽性結(jié)果的發(fā)酵管，用3mm接種環(huán)將培養(yǎng)物（2-3環(huán)）轉(zhuǎn)接到EC培養(yǎng)液中,，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h（提高培養(yǎng)溫度可造成不利于來自自然環(huán)境的大腸菌群的生長）,。培養(yǎng)后立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實為糞大腸菌群陽性,。

2．濾膜法

濾膜是一種微孔性濾膜,，孔徑0.45μm。將水樣注入已滅菌的放有濾膜的過濾器中,，經(jīng)過抽濾,，細(xì)菌即被截留在膜上，然后將濾膜貼于M-FC培養(yǎng)基上,，在44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h±2h,。糞大腸菌群菌落在M-FC培養(yǎng)基上呈藍色或藍綠色，其他非糞大腸菌群菌落成灰色,、淡黃色或無色,。正常情況下，由于溫度和玫瑰酸鹽試劑的選擇性作用,，在M-FC培養(yǎng)基上很少見到非糞大腸菌菌落,。

二．兩種方法的注意事項

1．培養(yǎng)溫度的要求  總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在腸道中外，在自然環(huán)境中的水與土壤中也經(jīng)常存在，但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的zui合適溫度為25℃左右,，如在37℃培養(yǎng)則仍可生長,，但如將培養(yǎng)溫度再升高至44．5℃，則不再生長,，而直接來自糞便的大腸菌群細(xì)菌,，習(xí)慣于37℃左右生長，如將培養(yǎng)溫度升高至44．5℃仍可繼續(xù)生長,。因此,，可用提高培養(yǎng)溫度的方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分，兩種方法也都基于此理,。將接種好的樣品或裝有濾膜的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱時,，箱內(nèi)溫度一定要達到所要求的溫度（44.5±0.5℃）時，方可放入,。如用恒溫水浴箱時,，其水面要高于接種物面，放濾膜的培養(yǎng)皿要沉到水浴箱底部,。

2．加氯水樣的處理  經(jīng)氯處理消毒過的水樣,，水中含有一定量的余氯，使大腸菌群處于受損或受抑制狀態(tài),，在采集水樣時應(yīng)提前在采樣瓶中加硫代硫酸鈉,，硫代硫酸鈉可以脫氯，使受損的細(xì)菌得以復(fù)蘇與修復(fù),，從而避免出現(xiàn)計數(shù)結(jié)果偏低甚至假陰性的現(xiàn)象,。此外余氯對濾膜法培養(yǎng)的細(xì)菌其抑制作用尤為明顯，所以抽濾時應(yīng)對水樣進行大量無菌水稀釋,，以減少余氯的殘留,。

3．樣品的保存  采樣用的容器使用前應(yīng)蓋好瓶蓋，用牛皮紙將瓶蓋和瓶頸處包裹好,，置干燥箱160℃-170℃干熱滅菌2h,，或用高壓蒸汽滅菌器121℃滅菌15min。采樣后水樣的正確保存也很重要,，如保存不當(dāng)可使樣品中的大腸菌群細(xì)菌死亡或在一定條件下再生長,，這些都將影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測室接到水樣后,，應(yīng)立即檢測,，如因故不能檢測時，應(yīng)立即將樣品置于冰箱內(nèi)（2℃-10℃）并于2小時內(nèi)檢測,。

4．培養(yǎng)物質(zhì)的制備與保存

 ⑴.多管發(fā)酵法所使用的培養(yǎng)液在分裝于各發(fā)酵管中后,，應(yīng)將發(fā)酵管盡快放于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min（注意：這個溫度也應(yīng)控制好，既達到滅菌的作用,，還要防止培養(yǎng)物質(zhì)分解流失）,，然后貯存于冰箱或暗處備用。

⑵.濾膜法所采用的M-FC培養(yǎng)基多使用外購的成品,，培養(yǎng)基中苯胺藍的純度和質(zhì)量往往影響菌落的顏色,，因此，無菌包裝的成套培養(yǎng)基在使用前,，先接種典型糞大腸菌,，以觀察對比菌落的顏色，來鑒定其穩(wěn)定性,。

5．結(jié)果統(tǒng)計 

⑴.多管發(fā)酵法的結(jié)果是根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目,，從MPN表中查得相應(yīng)的MPN指數(shù)，來計算每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值,。MPN是“Most Probable Number”的縮寫,，指zui大可能數(shù)，它是根據(jù)統(tǒng)計學(xué)理論,，估計水體中的菌群密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法,，所以準(zhǔn)確判斷不同接種量發(fā)酵管的陽性數(shù)是非常重要的，否則將導(dǎo)致較大偏差,。

⑵.濾膜法的結(jié)果是計數(shù)濾膜上呈藍或藍綠色的菌落,，來計算出每升水樣中的糞大腸菌群數(shù)。所以為便于計數(shù),，減少誤差，理想的水樣體積是一片濾膜上生長20-60個糞大腸菌群菌落,。

三．在實際中的應(yīng)用探討

1．檢測方法對樣品的適用性 

⑴.多管發(fā)酵法由于只需要根據(jù)水樣的取樣量來決定將樣品培養(yǎng)于何種培養(yǎng)液中（單倍或是三倍乳糖）進行培養(yǎng),，因此理論上可適用于各種水樣，但由于受發(fā)酵管容積的限制,，其更適合檢測水源水,、地表水和污染源廢水（取樣量不大），而且如果接種的水樣量不是MPN表中的三種接種量時,，還需用公式進行換算,。

⑵.濾膜法主要是采用抽濾裝置將細(xì)菌截留在濾膜上，然后將濾膜貼附在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),，因此可用于檢測體積較大的水樣,，但受濾膜孔徑的限制，在檢測混濁度高（污染源廢水）,、非大腸桿菌類細(xì)菌密度大（河湖水）的水樣時,，對菌落計數(shù)統(tǒng)計有一定影響，此外，如水樣中有毒性物質(zhì)較高,，也會在濾膜上形成累積,，抑制細(xì)菌培養(yǎng)。

2．檢測時間及操作過程的繁瑣度

⑴.多管發(fā)酵法需要經(jīng)過初發(fā)酵試驗和復(fù)發(fā)酵試驗兩個過程后才能根據(jù)不同接種量的發(fā)酵管所出現(xiàn)陽性結(jié)果的數(shù)目,，從MPN表中查得相應(yīng)的MPN指數(shù),，從而zui后得出每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值?？梢钥闯?，多管發(fā)酵法的培養(yǎng)時間至少需要2天以上，且對接種量,、每一接種量的發(fā)酵管數(shù)都有嚴(yán)格要求（MPN表多采用9管,、15管發(fā)酵管，接種量為10ml,、1ml,、0.1ml3種體積查詢），否則結(jié)果難以統(tǒng)計,。

⑵.濾膜法目前主要采用成套NPS（濾膜+培養(yǎng)基+培養(yǎng)皿）進行細(xì)菌截留和培養(yǎng),，操作簡單，使用時只需用少量無菌水潤濕培養(yǎng)基墊即可使用,，培養(yǎng)時間1天左右,，能比多管發(fā)酵法更快地獲得結(jié)果，還具有高度的再現(xiàn)性和精密性,。此外由于采用單片無菌包裝,，節(jié)省了滅菌時間，還避免操作過程中的二次污染,，并且長有菌落的濾膜片可在紫外線滅菌,、干燥后作為檢測記錄*保存，更符合計量認(rèn)證規(guī)范,。

3．檢測成本的考慮

⑴.多管發(fā)酵法所用的發(fā)酵管,、小玻璃倒管和塑料蓋可在清洗、高壓滅菌和紫外線消毒后重復(fù)使用,，液態(tài)培養(yǎng)基可自行配制或采用市售已配好的綜合培養(yǎng)基,，檢測的成本不高。由于其方法較繁瑣,，目前正有一種經(jīng)過US EPA認(rèn)證的水和廢水中糞大腸菌群檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法逐步取代它,，這種在美國、日本和加拿大等廣泛使用的檢測技術(shù)在國內(nèi)也有一定使用（北京市環(huán)境檢測中心,、北京市排水集團檢測中心等）,，這種方法就是使用IDEXX colilert試劑來檢測水中糞大腸菌,，雖然它是基于多管發(fā)酵法原理，不過卻將其操作大大簡化了,。當(dāng)然,，伴隨著操作的簡化，檢測成本也大幅提高,，設(shè)備基本上全是進口的,，前期投入大概在8萬元至10萬元人民幣之間，且由于采樣瓶,、試劑和密封計數(shù)盤都是一次性使用,，單個樣品的檢測成本也將達到200元人民幣左右。

⑵.濾膜法主要采用的抽濾裝置（拋光不銹鋼3歧管過濾器,、500ml漏斗,、無油隔膜真空正壓兩用泵和手動無菌水加液器）也基本上來自于進口，目前很多單位使用的都是德國賽多利斯公司生產(chǎn)的產(chǎn)品,，其前期投入大概在2萬元至3萬元人民幣左右（包括100套無菌包裝的NPS,，12元/每套）。由于每個樣品需采用3種不同的稀釋比進行過濾培養(yǎng),，要使用3套NPS,，所以單個樣品的檢測成本在50元人民幣左右。

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